I det bysantinska riket var kyrka och stat oupplöst kopplade till väsentliga aspekter av ett enda kristet imperium som ansågs vara den jordiska motsvarigheten till den himmelska politiken. Det var därför Justinianus plikt, som det var för senare bysantinska kejsare, att främja kyrkans goda regering och att upprätthålla ortodoxa läror. Detta förklarar varför så många av hans lagar behandlar i detalj religiösa problem. Hedningar, kättare och samaritaner, till exempel, var förbjudna att undervisa något ämne alls, och även om de uppskattade det klassiska arvet fullt ut, utvisade Justinian hedniska lärare från den en gång berömda akademin i Aten, en handling riktad mot hedendom snarare än grekisk filosofi. .
Justinianus huvudsakliga doktrinära problem var konflikten mellan den ortodoxa uppfattningen som accepterades vid rådet i Chalcedon (451), att den gudomliga och mänskliga naturen samexisterar i Kristus, och den monofysitiska läran som betonade hans gudomliga natur. Monofysitism hölls starkt i Syrien och Egypten och var nära knuten till växande nationella känslor och förargelse över det bysantinska styre. Justinianus, vars fru, Theodora, var en stark förkämpe för monofysiterna, ville inte förlora de östra provinserna, men han visste å andra sidan att eventuella eftergifter för dem nästan säkert skulle främja Rom och väst. Justinian försökte tvinga de ortodoxa västerländska biskoparna att komma fram till en kompromiss med monofysiterna, och han gick till och med så långt att han höll påven Vigilius mot sin vilja i Konstantinopel och fördömde några skrifter av viktiga kyrkliga personer i Antiokia i ett försök att uppnå sin syfte. Det andra rådet i Konstantinopel (553) bekräftade äntligen den kalcedoniska ståndpunkten och fördömde de antiokiska misstänkta skrifterna. Justinianus uppnådde dock inget genom episoden; han förlikade inte monofysiterna, han rasade Antiochia över attacken mot dess lärare, och han väckte Rom särskilt genom sin hantering av påven Vigilius och hans försök att avgöra doktrinära frågor. Rådets förordningar accepterades inte av Vigilius efterträdare, och en splittring inträffade således mellan Rom och Konstantinopel som varade fram till 610.
Mot slutet av hans regeringstid drog Justinianus sig till viss del ur offentliga angelägenheter och var upptagen med teologiska problem. Han upphörde till och med till kätteri när han i slutet av 564 utfärdade ett edikt om att Kristi människokropp var oförstörbar och bara tycktes lida (doktrinen kallad Aftartodocetism). Detta väckte omedelbar protest, och många kyrkor vägrade att prenumerera på det, men frågan tappades med kejsarens död, vid vilken tid tronen gick till sin brorson Justin II år 565. För att beskriva Justinianus intresse och aktivitet i kyrkans angelägenheter som kejsarsopapism ( staten som kontrollerar kyrkan) är vilseledande. Justinianus, liksom efterträdande bysantinska kejsare, betraktade sig själv som Kristi underkyrka, och det östra romerska riket visste ingen sådan tydlig åtskillnad mellan kyrka och stat som utvecklades i den latinska kristenheten.