W Cesarstwie Bizantyjskim kościół i państwo były nierozerwalnie połączone jako podstawowe aspekty pojedynczego chrześcijańskiego imperium, które było uważane za ziemski odpowiednik niebiańskiego państwa. Dlatego obowiązkiem Justyniana, podobnie jak późniejszych cesarzy bizantyjskich, było promowanie dobrego zarządzania Kościołem i przestrzeganie ortodoksyjnego nauczania. To wyjaśnia, dlaczego tak wiele jego praw szczegółowo dotyczy problemów religijnych. Na przykład poganom, heretykom i Samarytanom zabroniono nauczać jakiegokolwiek przedmiotu i chociaż w pełni doceniał dziedzictwo klasyczne, Justynian wyrzucił pogańskich nauczycieli ze słynnej niegdyś Akademii w Atenach, co było akcją skierowaną raczej przeciwko pogaństwu niż filozofii .
Głównym problemem doktrynalnym Justyniana był konflikt między ortodoksyjnym poglądem przyjętym na Soborze Chalcedońskim (451), że natura boska i ludzka współistnieją w Chrystusie, a nauką Monofizytów, która podkreślała jego boską naturę. Monofizytyzm był silnie utrzymywany w Syrii i Egipcie i był ściśle powiązany z rosnącymi uczuciami narodowymi i niechęcią do rządów Bizancjum. Justynian, którego żona Teodora była silną orędowniczką Monofizytów, nie chciał stracić wschodnich prowincji, ale z drugiej strony wiedział, że jakiekolwiek ustępstwa na ich rzecz prawie na pewno zraziłyby Rzym i Zachód. Justynian próbował zmusić ortodoksyjnych biskupów zachodnich do zawarcia kompromisu z Monofizytami, a nawet posunął się do tego, że w Konstantynopolu trzymał papieża Wigiliusza wbrew jego woli i potępił niektóre pisma ważnych osobistości Kościoła cel. Drugi sobór w Konstantynopolu (553) ostatecznie potwierdził stanowisko chalcedońskie i potępił podejrzane pisma Antiochii. Justynian nie osiągnął jednak nic w tym odcinku; nie pogodził się z monofizytami, rozwścieczył Antiochię atakiem na jej nauczycieli, a Rzym podniecił szczególnie swoim traktowaniem papieża Wigiliusza i próbą ustalenia spraw doktrynalnych. Dekrety soboru nie zostały zaakceptowane przez następców Wigiliusza iw ten sposób doszło do schizmy między Rzymem a Konstantynopolem, która trwała do 610 roku.
Pod koniec swojego panowania Justynian w pewnym stopniu wycofał się ze spraw publicznych i był zajęty problemami teologicznymi. Popadł nawet w herezję, kiedy pod koniec 564 roku wydał edykt stwierdzający, że ludzkie ciało Chrystusa jest nieprzekupne i wydaje się tylko cierpieć (doktryna zwana afthartodocetism). Ten wywołał natychmiastowy protest i wielu duchownych odmówiło podpisania się pod jego zapisem, ale sprawa została zarzucona wraz ze śmiercią cesarza, kiedy to tron przeszedł w ręce jego siostrzeńca Justyna II w 565 roku. Opisać zainteresowanie i działalność Justyniana w sprawach kościoła jako cezaropapizm ( państwo sprawujące kontrolę nad kościołem) jest mylące. Justynian, podobnie jak następni cesarze bizantyjscy, uważał się za wiceregenta Chrystusa, a wschodnie imperium rzymskie nie znało tak wyraźnego rozróżnienia między kościołem a państwem, jakie rozwinęło się w chrześcijaństwie łacińskim.