I det byzantinske imperium var kirke og stat uopløseligt forbundet som væsentlige aspekter af et enkelt kristent imperium, der blev betragtet som den jordiske modstykke til den himmelske politik. Det var derfor Justinians pligt, som det var for senere byzantinske kejsere, at fremme kirkens gode regering og opretholde ortodokse lære. Dette forklarer, hvorfor så mange af hans love behandler detaljerede religiøse problemer. Hedninger, kættere og samaritanere blev for eksempel forbudt at undervise i noget emne overhovedet, og selvom de var fuldt taknemmelige for den klassiske arv, udviste Justinian hedenske lærere fra det engang berømte Akademi i Athen, en handling rettet mod hedenskhed snarere end græsk filosofi .
Justinianus vigtigste doktrinære problem var konflikten mellem det ortodokse synspunkt, der blev accepteret på Chalcedon-rådet (451), at den guddommelige og menneskelige natur eksisterer sammen i Kristus, og den monofysitiske lære, der understregede hans guddommelige natur. Monofysitisme blev stærkt holdt i Syrien og Egypten og var tæt allieret med voksende nationale følelser og vrede over det byzantinske styre. Justinian, hvis kone, Theodora, var en stærk forkæmper for monofysitterne, ønskede ikke at miste de østlige provinser, men han vidste på den anden side, at enhver indrømmelse til dem næsten helt sikkert ville fremmedgøre Rom og Vesten. Justinian forsøgte at tvinge de ortodokse vestlige biskopper til at nå frem til et kompromis med monofysitterne, og han gik endda så langt som at holde pave Vigilius mod sin vilje i Konstantinopel og fordømme nogle skrifter af vigtige kirkefigurer i Antiokia i et forsøg på at nå sit sigte. Det andet råd i Konstantinopel (553) bekræftede endelig den kalcedonske holdning og fordømte de antiokiske mistænkte skrifter. Justinian opnåede dog intet ved episoden; han forligte ikke monofysitterne, han rasede Antiokia over angrebet på dets lærere, og han vækkede Rom især ved sin håndtering af pave Vigilius og hans forsøg på at bestemme doktrinære forhold. Rådets dekreter blev ikke accepteret af Vigilius efterfølgere, og der skete således en skisma mellem Rom og Konstantinopel, der varede indtil 610.
Mod slutningen af hans regeringstid trak Justinian sig til en vis grad tilbage fra offentlige anliggender og var optaget af teologiske problemer. Han faldt endda i kætteri, da han i slutningen af 564 udstedte et edikt om, at Kristi menneskelige legeme var uforgængelig og kun syntes at lide (doktrinen kaldet Aphthartodocetism). Dette fremkaldte øjeblikkelig protest, og mange kirkelige nægtede at abonnere på det, men sagen blev droppet med kejserens død, på hvilket tidspunkt tronen blev overført til sin nevø Justin II i 565. At beskrive Justinianus interesse og aktivitet i kirkesager som kejsersnit tilstand, der kontrollerer kirken) er vildledende. Justinian betragtede som efterfølgende byzantinske kejsere sig selv som Kristi vicegener, og det østlige romerske imperium kendte ikke en så klar skelnen mellem kirke og stat som udviklet i den latinske kristenhed.