Omvendt transkription begynder, når viruspartiklen kommer ind i cytoplasmaet i en målcelle. Det virale RNA-genom kommer ind i cytoplasmaet som en del af et nukleoproteinkompleks, der ikke er blevet godt karakteriseret. Processen med omvendt transkription genererer i cytoplasmaet en lineær DNA-duplex via en indviklet række trin. Dette DNA er colinear med sin RNA-skabelon, men det indeholder terminale duplikationer kendt som de lange terminale gentagelser (LTRer), der ikke er til stede i viralt RNA (fig. 1). Ekstramodeller til omvendt transkription foreslår, at der kræves to specialiserede skabelonomskiftere kendt som strengoverførselsreaktioner eller “spring” for at generere LTRerne.
Figur 1
Omvendt transkription af det virale RNA-genom genererer en lineær DNA-duplex. Positionerne i R-, U5- og U3-regionerne, polypurinkanalen (PPT) og det primerbindende sted (PBS) er angivet. Omvendt transkription skaber duplikationer af U5 (mere …)
Retroviral DNA-syntese er absolut afhængig af de to forskellige enzymatiske aktiviteter ved RT: a DNA-polymerase, der kan bruge enten RNA eller DNA som en skabelon, og en nuklease, betegnet ribonuklease H (RNase H), der er specifik for RNA-strengen af RNA: DNA-duplekser. Selv om en rolle for andre proteiner ikke kan udelukkes, og det er sandsynligt, at visse virale proteiner (fx nucleocapsid, NC) øger effektiviteten af revers transkription, alle de enzymatiske funktioner, der kræves for at omplet række af trin involveret i dannelsen af et retroviralt DNA kan tilskrives enten DNA-polymerasen eller RNase H af RT. Processen med retroviral DNA-syntese antages at følge skemaet skitseret i figur 2:
Minusstrenget DNA-syntese initieres ved anvendelse af 3enden af et delvist uopviklet overførsels-RNA, der anneales til primerbindingen site (PBS) i genomisk RNA som en primer. Minusstreng-DNA-syntese fortsætter, indtil 5-enden af genomisk RNA er nået, hvilket genererer et DNA-mellemprodukt med diskret længde kaldet minus-streng stærk-stop-DNA (–sssDNA). Da bindingsstedet for tRNA-primeren er nær 5-enden af viralt RNA, er –sssDNA relativt kort i størrelsesordenen 100-150 baser
Efter RNase-H-medieret nedbrydning af RNA-strengen af RNA: –sssDNA duplex, den første strengoverførsel får –sssDNA til at blive annealet til 3enden af et viralt genomisk RNA. Denne overførsel medieres af identiske sekvenser kendt som de gentagne (R) sekvenser, som er til stede ved 5- og 3enden af RNA-genomet. 3enden af –sssDNA blev kopieret fra R-sekvenserne ved 5-enden af viral genom og indeholder derfor sekvenser, der er komplementære til R. Efter at RNA-skabelonen er fjernet, kan -sssDNA annealere til R-sekvenserne ved 3 slutningen af RNA-genomet. Udglødningsreaktionen ser ud til at være lette af NC.
Når –sssDNA er blevet overført til 3R-segmentet på viralt RNA, genoptages minus-streng DNA-syntese ledsaget af RNase H-fordøjelse af skabelonen strand. Denne nedbrydning er dog ikke komplet.
RNA-genomet indeholder en kort polypurinkanal (PPT), der er relativt resistent over for RNase H-nedbrydning. Et defineret RNA-segment afledt af PPT-primer plus-streng DNA-syntese. Plusstrengssyntese standses, efter at en del af primeren tRNA transskriberes, hvilket giver et DNA kaldet plus-streng stærk-stop-DNA (+ sssDNA). Selvom alle retrovirusstammer genererer en defineret plus-streng-primer fra PPT, genererer nogle vira yderligere plus-streng-primere fra RNA-genomet.
RNase H fjerner primer-tRNAet og udsætter sekvenser i + sssDNA, der er komplementær med sekvenser ved eller nær 3enden af plus-streng-DNA.
Annealing af de komplementære PBS-segmenter i + sssDNA og minus-streng DNA udgør den anden strengoverførsel.
Plus- og minusstrengssynteser afsluttes derefter, hvor plus- og minusstrengene af DNA hver tjener som en skabelon for den anden streng.
Figur 2
Process med revers transkription af det retrovirale genom. (Sort linje) RNA; (lys farve) minusstrengede DNAer; (mørk farve) plus-strenget DNA. Se tekst for en beskrivelse af denne proces.
En mere detaljeret beskrivelse af disse trin præsenteres nedenfor.