Nellimpero bizantino, chiesa e stato erano indissolubilmente legati come aspetti essenziali di un unico impero cristiano che era pensato come la controparte terrestre del sistema politico celeste. Era quindi dovere di Giustiniano, come fu per i successivi imperatori bizantini, promuovere il buon governo della chiesa e sostenere linsegnamento ortodosso. Questo spiega perché tante delle sue leggi trattano in dettaglio i problemi religiosi. A pagani, eretici e samaritani, per esempio, era proibito insegnare qualsiasi materia e, sebbene apprezzava pienamente leredità classica, Giustiniano espulse gli insegnanti pagani dalla famosa Accademia di Atene, unazione diretta contro il paganesimo piuttosto che la filosofia greca .
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Il principale problema dottrinale di Giustiniano era il conflitto tra la visione ortodossa accettata al Concilio di Calcedonia (451), che la natura divina e quella umana coesistono in Cristo e linsegnamento monofisita che enfatizzava la sua natura divina. Il monofisismo era fortemente sostenuto in Siria ed Egitto ed era strettamente alleato ai crescenti sentimenti nazionali e al risentimento per il dominio bizantino. Giustiniano, la cui moglie, Teodora, era una forte paladina dei monofisiti, non voleva perdere le province orientali, ma sapeva, daltra parte, che qualsiasi concessione ad esse avrebbe quasi certamente alienato Roma e lOccidente. Giustiniano cercò di costringere i vescovi ortodossi occidentali ad arrivare a un compromesso con i monofisiti, e arrivò persino a trattenere papa Vigilio contro la sua volontà a Costantinopoli e a condannare alcuni scritti di importanti figure della chiesa di Antiochia nel tentativo di raggiungere il suo scopo. Il secondo Concilio di Costantinopoli (553) finalmente riaffermò la posizione di Calcedonia e condannò gli scritti sospetti di Antiochia. Giustiniano non ottenne nulla dallepisodio, tuttavia; non conciliò i monofisiti, fece infuriare Antiochia per lattacco ai suoi insegnanti e suscitò Roma in particolare per il modo in cui trattava papa Vigilio e il suo tentativo di determinare questioni dottrinali. I decreti del concilio non furono accettati dai successori di Vigilio, e così si verificò uno scisma tra Roma e Costantinopoli che durò fino al 610.
Verso la fine del suo regno, Giustiniano in una certa misura si ritirò dagli affari pubblici e era occupato con problemi teologici. Cadde persino nelleresia quando, alla fine del 564, emanò un editto in cui affermava che il corpo umano di Cristo era incorruttibile e sembrava solo soffrire (la dottrina chiamata Aphthartodocetism). Questo suscitò una protesta immediata e molti ecclesiastici si rifiutarono di sottoscriverlo, ma la questione fu abbandonata con la morte dellimperatore, momento in cui il trono passò a suo nipote Giustino II nel 565. Per descrivere linteresse e lattività di Giustiniano negli affari della chiesa come cesaropapismo ( stato che controlla la chiesa) è fuorviante. Giustiniano, come i successivi imperatori bizantini, si considerava il viceregente di Cristo e lImpero Romano dOriente non conosceva una distinzione così netta tra chiesa e stato come si è sviluppata nella cristianità latina.