In het Byzantijnse rijk waren kerk en staat onlosmakelijk met elkaar verbonden als essentiële aspecten van een enkel christelijk rijk dat werd beschouwd als de aardse tegenhanger van het hemelse staatsbestel. Het was daarom de plicht van Justinianus, zoals het was voor latere Byzantijnse keizers, om het goede bestuur van de kerk te bevorderen en de orthodoxe leer hoog te houden. Dit verklaart waarom zoveel van zijn wetten in detail religieuze problemen behandelen. Heidenen, ketters en Samaritanen mochten bijvoorbeeld geen enkel vak onderwijzen, en hoewel Justinianus de klassieke erfenis ten volle waardeerde, stuurde Justinianus heidense leraren weg van de ooit beroemde Academie in Athene, een actie gericht tegen het heidendom in plaats van tegen de Griekse filosofie. .
Justinianus belangrijkste leerstellige probleem was het conflict tussen de orthodoxe opvatting die op het concilie van Chalcedon (451) werd aanvaard, dat de goddelijke en menselijke natuur naast elkaar in Christus bestaan, en de monofysitische leer die zijn goddelijke aard benadrukte. Monofysitisme was sterk aanwezig in Syrië en Egypte en was nauw verbonden met groeiende nationale gevoelens en afkeer van de Byzantijnse overheersing. Justinianus, wiens vrouw, Theodora, een sterke kampioen van de monofysieten was, wilde de oostelijke provincies niet verliezen, maar aan de andere kant wist hij dat alle concessies aan hen Rome en het Westen vrijwel zeker zouden vervreemden. Justinianus probeerde de orthodoxe westerse bisschoppen te dwingen tot een compromis met de monofysieten te komen, en hij ging zelfs zo ver dat hij paus Vigilius tegen zijn wil in Constantinopel vasthield en enkele geschriften van belangrijke kerkfiguren in Antiochië veroordeelde in een poging zijn doel te bereiken. doel. Het tweede concilie van Constantinopel (553) bevestigde ten slotte het Chalcedonische standpunt en veroordeelde de geschriften van Antiochië. Justinianus bereikte echter niets met de aflevering; hij verzoende de monofysieten niet, hij maakte Antiochië woedend door de aanval op zijn leraren, en hij wekte Rome vooral op door zijn behandeling van paus Vigilius en zijn poging om leerstellige kwesties te bepalen. De decreten van het concilie werden niet aanvaard door Vigilius opvolgers, en aldus ontstond er een schisma tussen Rome en Constantinopel dat duurde tot 610.
Tegen het einde van zijn regering trok Justinianus zich enigszins terug uit openbare aangelegenheden en hield zich bezig met theologische problemen. Hij verviel zelfs in ketterij toen hij eind 564 een edict uitvaardigde waarin stond dat het menselijk lichaam van Christus onvergankelijk was en alleen maar leek te lijden (de leerstelling genaamd Afthartodocetisme). Dit wekte onmiddellijk protest op, en veel geestelijken weigerden zich eraan te abonneren, maar de zaak werd afgewezen met de dood van de keizer, waarop de troon in 565 overging op zijn neef Justin II. Om Justinianus interesse en activiteit in kerkelijke aangelegenheden te omschrijven als caesaropapisme ( staat die de controle heeft over de kerk) is misleidend. Justinianus beschouwde zichzelf, net als de opvolgers van Byzantijnse keizers, als de onderkoning van Christus, en het Oost-Romeinse Rijk kende niet zon duidelijk onderscheid tussen kerk en staat als ontwikkeld in het Latijnse christendom.