Omgekeerde transcriptie begint wanneer het virale deeltje het cytoplasma van een doelcel binnendringt. Het virale RNA-genoom komt het cytoplasma binnen als onderdeel van een nucleoproteïnecomplex dat niet goed is gekarakteriseerd. Het proces van omgekeerde transcriptie genereert in het cytoplasma een lineaire DNA-duplex via een ingewikkelde reeks stappen. Dit DNA is colineair met zijn RNA-sjabloon, maar het bevat terminale duplicaties die bekend staan als de lange terminale herhalingen (LTRs) die niet aanwezig zijn in viraal RNA (Fig. 1). Bestaande modellen voor reverse transcriptie stellen voor dat twee gespecialiseerde sjabloonwissels, bekend als streng-transferreacties of “jumps”, nodig zijn om de LTRs te genereren.
Figuur 1
Reverse transcriptie van het virale RNA-genoom genereert een lineaire DNA-duplex. De posities van de R-, U5- en U3-regios, het polypurine kanaal (PPT) en de primer-bindingsplaats (PBS) zijn aangegeven. Reverse transcriptie creëert duplicaties van de U5 (meer …)
Retrovirale DNA-synthese is absoluut afhankelijk van de twee verschillende enzymatische activiteiten van RT: a DNA-polymerase dat RNA of DNA als template kan gebruiken, en een nuclease, ribonuclease H (RNase H) genaamd, dat specifiek is voor de RNA-streng van RNA: DNA-duplexen. Hoewel een rol voor andere eiwitten niet kan worden uitgesloten, en het is waarschijnlijk dat bepaalde virale eiwitten (bijv. nucleocapside, NC) de efficiëntie van reverse transcriptie verhogen, waarbij alle enzymatische functies die nodig zijn om c om de reeks stappen die betrokken zijn bij het genereren van een retroviraal DNA te voltooien, kan worden toegeschreven aan ofwel het DNA-polymerase of het RNase H van RT. Aangenomen wordt dat het proces van retrovirale DNA-synthese het schema volgt dat in Figuur 2 wordt beschreven:
Minus-streng DNA-synthese wordt geïnitieerd met behulp van het 3-uiteinde van een gedeeltelijk afgewikkeld transfer-RNA dat wordt gehecht aan de primerbinding site (PBS) in genomisch RNA, als primer. Minusstrengs DNA-synthese gaat door totdat het 5′-uiteinde van genomisch RNA is bereikt, waardoor een DNA-tussenproduct van discrete lengte wordt gegenereerd dat minusstrengs sterke stop-DNA (-sssDNA) wordt genoemd. Omdat de bindingsplaats voor de tRNA-primer dichtbij het 5-uiteinde van viraal RNA ligt, is –sssDNA relatief kort, in de orde van 100-150 basen
Na door RNase-H gemedieerde afbraak van de RNA-streng van het RNA: –sssDNA duplex, zorgt de overdracht van de eerste streng ervoor dat –sssDNA wordt gehecht aan het 3′-uiteinde van een viraal genomisch RNA. Deze overdracht wordt gemedieerd door identieke sequenties die bekend staan als de herhaalde (R) sequenties, die aanwezig zijn aan de 5- en 3-uiteinden van het RNA-genoom. Het 3′-uiteinde van –sssDNA werd gekopieerd van de R-sequenties aan het 5′-uiteinde van het virale genoom en bevat daarom sequenties die complementair zijn aan R. Nadat de RNA-template is verwijderd, kan –sssDNA aan de R-sequenties op de 3 ′ hybridiseren. einde van het RNA-genoom. De annealing-reactie lijkt te worden gefaciliteerd door de NC.
Zodra het –sssDNA is overgebracht naar het 3′R-segment op viraal RNA, wordt de minusstrengs DNA-synthese hervat, vergezeld van RNase H-digestie van de template strand. Deze afbraak is echter niet volledig.
Het RNA-genoom bevat een kort polypurine kanaal (PPT) dat relatief resistent is tegen RNase H-afbraak. Een gedefinieerd RNA-segment afgeleid van de PPT-priemgetallen plus-streng DNA-synthese. Plusstrengssynthese wordt gestopt nadat een deel van het primer-tRNA omgekeerd is getranscribeerd, wat een DNA oplevert dat plusstrengs strong-stop-DNA (+ sssDNA) wordt genoemd. Hoewel alle stammen van retrovirussen een gedefinieerde plus-streng primer genereren van de PPT, genereren sommige virussen extra plus-streng primers uit het RNA-genoom.
RNase H verwijdert de primer-tRNA, waardoor sequenties in + sssDNA die complementair aan sequenties op of nabij het 3-uiteinde van plus-streng-DNA.
Gloeien van de complementaire PBS-segmenten in + sssDNA en minus-streng-DNA vormt de overdracht van de tweede streng.
Plus- en min-strengsyntheses worden vervolgens voltooid, waarbij de plus- en min-strengen van DNA elk dienen als een sjabloon voor de andere streng.
Figuur 2
Proces van reverse transcriptie van het retrovirale genoom. (Zwarte lijn) RNA; (lichte kleur) min-streng-DNAs; (donkere kleur) plus-streng DNA. Zie tekst voor een beschrijving van dit proces.
Hieronder wordt een meer gedetailleerde beschrijving van deze stappen gegeven.