I det bysantinske riket var kirke og stat uløselig knyttet sammen som vesentlige aspekter av et enkelt kristent imperium som ble ansett som den jordiske motstykket til den himmelske politikken. Det var derfor Justinians plikt, som det var for senere bysantinske keisere, å fremme kirkens gode regjering og å opprettholde ortodoks læresetning. Dette forklarer hvorfor så mange av lovene hans behandler religiøse problemer i detalj. Hedninger, kjettere og samaritanere ble for eksempel forbudt å undervise i noe fag overhodet, og selv om han fullt ut takket den klassiske arven, utviste Justinian hedenske lærere fra det en gang så berømte akademiet i Athen, en handling rettet mot hedenskhet snarere enn gresk filosofi. .
Justinians viktigste doktrinære problem var konflikten mellom det ortodokse synet som ble akseptert på Chalcedon-rådet (451), om at den guddommelige og menneskelige natur eksisterer sammen i Kristus, og den monofysittiske læren som understreket hans guddommelige natur. Monofysittisme ble sterkt holdt i Syria og Egypt og var nær alliert med økende nasjonale følelser og harme over det bysantinske styre. Justinian, hvis kone, Theodora, var en sterk forkjemper for monofysittene, ønsket ikke å miste de østlige provinsene, men han visste derimot at eventuelle innrømmelser til dem nesten helt sikkert ville fremmedgjøre Roma og Vesten. Justinian prøvde å tvinge de ortodokse vestlige biskopene til å komme fram til et kompromiss med monofysittene, og han gikk til og med så langt at han holdt pave Vigilius mot sin vilje i Konstantinopel og fordømte noen skrifter av viktige kirkefigurer i Antiokia i et forsøk på å oppnå sin mål. Det andre rådet i Konstantinopel (553) bekreftet endelig den kalcedonske posisjonen og fordømte antiokias mistenkte skrifter. Justinian oppnådde imidlertid ingenting ved episoden; han forlikte ikke monofysittene, han raset Antiokia av angrepet på lærerne, og han vekket Roma spesielt ved sin håndtering av pave Vigilius og hans forsøk på å avgjøre doktrinære forhold. Rådsdekretene ble ikke akseptert av Vigilius etterfølgere, og det skjedde således en splittelse mellom Roma og Konstantinopel som varte til 610.
Mot slutten av hans regjeringstid trakk Justinian seg til en viss grad ut av offentlige anliggender og var opptatt av teologiske problemer. Han falt til og med i kjetteri da han på slutten av 564 utstedte et edikt om at Kristi menneskekropp var uforgjengelig og bare så ut til å lide (doktrinen kalt Aftartodocetism). Dette vekket øyeblikkelig protest, og mange kirkelige nektet å abonnere på det, men saken ble henlagt med keiserens død, da overgikk tronen til sin nevø Justin II i 565. For å beskrive Justinians interesse og aktivitet i kirkesaker som keisersopapisme ( staten som har kontroll over kirken) er misvisende. Justinian betraktet seg selv som etterfølger av bysantinske keisere som Kristi underkonge, og det øst-romerske riket visste ikke noe så klart skille mellom kirke og stat som utviklet i den latinske kristenheten.