Omvendt transkripsjon begynner når viruspartikkelen kommer inn i cytoplasmaet til en målcelle. Det virale RNA-genomet kommer inn i cytoplasmaet som en del av et nukleoproteinkompleks som ikke har blitt godt karakterisert. Prosessen med omvendt transkripsjon genererer, i cytoplasmaet, en lineær DNA-dupleks via en intrikat serie av trinn. Dette DNA er colinear med sin RNA-mal, men det inneholder terminale duplikasjoner kjent som de lange terminale repetisjonene (LTRs) som ikke er tilstede i viralt RNA (figur 1). Eksisterende modeller for revers transkripsjon foreslår at to spesialiserte malbrytere kjent som strandoverføringsreaksjoner eller «hopp» kreves for å generere LTR.
Figur 1
Omvendt transkripsjon av det virale RNA-genomet genererer en lineær DNA-dupleks. Posisjonene til R-, U5- og U3-regionene, polypurinkanalen (PPT) og primer-bindingsstedet (PBS) er angitt. Omvendt transkripsjon skaper duplikasjoner av U5 (mer …)
Retroviral DNA-syntese er helt avhengig av de to forskjellige enzymatiske aktivitetene til RT: a DNA-polymerase som kan bruke enten RNA eller DNA som mal, og en nuklease, kalt ribonuklease H (RNase H), som er spesifikk for RNA-strengen av RNA: DNA-duplekser. Selv om en rolle for andre proteiner ikke kan utelukkes, og det er sannsynlig at visse virale proteiner (f.eks. nukleokapsid, NC) øker effektiviteten til revers transkripsjon, alle de enzymatiske funksjonene som kreves for å fullstendig rekke trinn involvert i generering av et retroviralt DNA kan tilskrives enten DNA-polymerasen eller RNase H av RT. Prosessen med retroviral DNA-syntese antas å følge skjemaet som er skissert i figur 2:
Minusstreng-DNA-syntese initieres ved bruk av 3enden av et delvis uviklet overførings-RNA som er glødet til primerbindingen site (PBS) i genomisk RNA, som en primer. Minus-streng DNA-syntese fortsetter til 5-enden av genomisk RNA er nådd, og genererer et DNA-mellomprodukt med diskret lengde som kalles minus-streng sterkstopp-DNA (–sssDNA). Siden bindingsstedet for tRNA-primeren er nær 5-enden av viralt RNA, er –sssDNA relativt kort, i størrelsesorden 100-150 baser
Etter RNase-H-mediert nedbrytning av RNA-strengen av RNA: –sssDNA dupleks, fører den første strengoverføringen –sssDNA til å bli glødet til 3enden av et viralt genomisk RNA. Denne overføringen formidles av identiske sekvenser kjent som de gjentatte (R) sekvensene, som er tilstede ved 5- og 3enden av RNA-genomet. 3end av -sssDNA ble kopiert fra R-sekvensene ved 5end av virusgenomet og inneholder derfor sekvenser som er komplementære til R. Etter at RNA-malen er fjernet, kan -sssDNA annealere til R-sekvensene ved 3 slutten av RNA-genomet. Annealing-reaksjonen ser ut til å bli lettere av NC.
Når –sssDNA har blitt overført til 3R-segmentet på viralt RNA, gjenopptas minus-streng DNA-syntese, ledsaget av RNase H-fordøyelse av malen Strand. Denne nedbrytningen er imidlertid ikke fullført.
RNA-genomet inneholder en kort polypurinkanal (PPT) som er relativt motstandsdyktig mot RNase H-nedbrytning. Et definert RNA-segment avledet fra PPT primer pluss-streng DNA-syntese. Pluss-streng-syntese stoppes etter at en del av primeren tRNA er omvendt transkribert, og gir et DNA som kalles pluss-streng sterk-stopp-DNA (+ sssDNA). Selv om alle stammer av retrovirus genererer en definert pluss-streng-primer fra PPT, genererer noen virus ytterligere pluss-streng-primere fra RNA-genomet.
RNase H fjerner primer-tRNA og utsetter sekvenser i + sssDNA som er komplementær til sekvenser ved eller nær 3enden av pluss-streng-DNA.
Annealing av de komplementære PBS-segmentene i + sssDNA og minus-streng-DNA utgjør den andre strengoverføringen.
Pluss- og minusstrengsynteser blir deretter fullført, med pluss- og minusstrengene av DNA som hver fungerer som en mal for den andre strengen.
Figur 2
Prosess med revers transkripsjon av det retrovirale genomet. (Svart linje) RNA; (lys farge) minusstrengede DNA-er; (mørk farge) pluss-streng DNA. Se tekst for en beskrivelse av denne prosessen.
En mer detaljert beskrivelse av disse trinnene presenteres nedenfor.