Dans l’Empire byzantin, l’Église et l’État étaient indissolublement liés en tant qu’aspects essentiels d’un seul empire chrétien qui était considéré comme la contrepartie terrestre du régime politique céleste. Cétait donc le devoir de Justinien, comme pour les empereurs byzantins ultérieurs, de promouvoir le bon gouvernement de léglise et de soutenir lenseignement orthodoxe. Cela explique pourquoi tant de ses lois traitent en détail des problèmes religieux. Les païens, les hérétiques et les samaritains, par exemple, se sont vu interdire denseigner quelque matière que ce soit et, bien quappréciant pleinement lhéritage classique, Justinien a expulsé les enseignants païens de la célèbre Académie dAthènes, une action dirigée contre le paganisme plutôt que contre la philosophie grecque. .
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Le principal problème doctrinal de Justinien était le conflit entre la vision orthodoxe acceptée au Concile de Chalcédoine (451), selon laquelle les natures divine et humaine coexistent en Christ, et lenseignement monophysite qui soulignait sa nature divine. Le monophysisme était fortement maintenu en Syrie et en Égypte et était étroitement lié aux sentiments nationaux croissants et au ressentiment envers la domination byzantine. Justinien, dont lépouse, Théodora, était un fervent champion des Monophysites, ne souhaitait pas perdre les provinces de lEst, mais il savait, en revanche, que toute concession à leur égard aliénerait presque certainement Rome et lOccident. Justinien a essayé de contraindre les évêques occidentaux orthodoxes à arriver à un compromis avec les monophysites, et il est même allé jusquà tenir le pape Vigilius contre sa volonté à Constantinople et à condamner certains écrits de personnalités importantes de lÉglise dAntioche dans un effort pour atteindre son objectif. avoir pour but. Le deuxième concile de Constantinople (553) a finalement réaffirmé la position chalcédonienne et condamné les écrits suspects dAntioche. Justinien na cependant rien réalisé par lépisode; il na pas concilié les monophysites, il a enragé Antioche par lattaque contre ses professeurs, et il a excité Rome particulièrement par sa manipulation du pape Vigilius et sa tentative de déterminer les questions doctrinales. Les décrets du concile ne furent pas acceptés par les successeurs de Vigilius, et un schisme se produisit donc entre Rome et Constantinople qui dura jusquen 610.
Vers la fin de son règne, Justinien se retira dans une certaine mesure des affaires publiques et était occupé par des problèmes théologiques. Il tomba même dans lhérésie quand, à la fin de 564, il publia un édit déclarant que le corps humain du Christ était incorruptible et ne semblait souffrir que (la doctrine appelée Aphthartodocétisme). Cela a suscité une protestation immédiate, et de nombreux ecclésiastiques ont refusé dy souscrire, mais laffaire a été abandonnée avec la mort de lempereur, date à laquelle le trône passa à son neveu Justin II en 565. Pour décrire lintérêt et lactivité de Justinien dans les affaires de lÉglise comme un césaropapisme ( lÉtat qui contrôle lÉglise) est trompeur. Justinien, comme les empereurs byzantins qui succédaient aux empereurs byzantins, se considérait comme le vice-agent du Christ, et lEmpire romain dOrient ne connaissait pas de distinction aussi nette entre lÉglise et lÉtat que celle développée dans la chrétienté latine.