Bysantin valtakunnassa kirkko ja valtio liittyivät erottamattomasti yhtenä kristillisen imperiumin olennaisina osa-alueina, jonka ajateltiin olevan taivaallisen politiikan maanpäällinen vastine. Siksi Justinianuksen, kuten myöhempien Bysantin keisarien, velvollisuutena oli edistää kirkon hyvää hallintoa ja tukea ortodoksista opetusta. Tämä selittää, miksi niin monet hänen laistaan käsittelevät yksityiskohtaisesti uskonnollisia ongelmia. Esimerkiksi pakanoilla, harhaoppisilla ja samarialaisilla kiellettiin opettamasta mitään aiheita, ja vaikka arvostavat täysin klassista perintöä, Justinian karkotti pakanalliset opettajat Ateenan aikoinaan kuuluisasta Akatemiasta, joka oli pikanaisuuden eikä kreikkalaisen filosofian vastainen toiminta. .
Justinianuksen tärkein opillinen ongelma oli ristiriita Chalcedonin kirkolliskokouksessa (451) hyväksytyn ortodoksisen näkemyksen välillä, jonka mukaan jumalallinen ja ihmisluonto esiintyvät rinnakkain Kristuksessa, ja hänen jumalallista luonnettaan korostavan monofysiikan opetuksen välillä. Monofysitismi oli vahvasti vallalla Syyriassa ja Egyptissä, ja se liittyi läheisesti kasvaviin kansallisiin tunteisiin ja bysanttilaiseen kauhuun. Justinianus, jonka vaimo Theodora oli vahva monofysiittien mestari, ei halunnut menettää itäisiä provinsseja, mutta tiesi toisaalta, että heille myönnetyt myönnytykset vierastaisivat Rooman ja lännen melkein varmasti. Justinianus yritti pakottaa ortodoksiset länsimaiset piispat pääsemään kompromissiin monofysiittien kanssa, ja hän jopa meni pitämään paavi Vigiliusta vastoin hänen tahtoaan Konstantinopolissa ja tuomitsemaan joitakin Antiochian tärkeiden kirkkohenkilöiden kirjoituksia pyrkiessään saavuttamaan hänen tavoite. Konstantinopolin toinen neuvosto (553) vahvisti lopulta Chalcedonian kannan ja tuomitsi Antiokian epäillyt kirjoitukset. Justinian ei kuitenkaan saavuttanut mitään jaksolla; hän ei sovinnut monofysiittejä, hän raivostutti Antiokian hyökkäyksillä sen opettajia vastaan ja herätti Rooman erityisesti käsittelemällä paavi Vigiliusia ja yrittäessään määrittää opillisia asioita. Vigiliuksen seuraajat eivät hyväksyneet neuvoston asetuksia, ja Rooman ja Konstantinopolin välillä tapahtui siten skisma, joka kesti vuoteen 610.
Hallituskautensa loppupuolella Justinianus vetäytyi jossain määrin julkisista asioista ja oli miehitetty teologisilla ongelmilla. Hän romahti jopa harhaoppiin, kun hän antoi vuoden 564 lopussa käskyn, jossa todettiin, että Kristuksen ihmiskeho oli katoamaton ja näytti vain kärsivän (oppi nimeltä Aphartodocetism). Tämä herätti välitöntä mielenosoitusta, ja monet kirkolliset kieltäytyivät liittymästä siihen, mutta asia hylättiin keisarin kuoleman myötä, jolloin valtaistuin siirtyi veljenpoikansa Justinus II: lle vuonna 565. Kuvata Justinianuksen kiinnostusta ja toimintaa kirkkoasioissa keisaropapiana ( kirkkoa hallitseva valtio) on harhaanjohtava. Justinianus, kuten seuranneet bysanttilaiset keisarit, piti itseään Kristuksen varajäsenenä, eikä Itä-Rooman valtakunta tiennyt tällaista selkeää eroa kirkon ja valtion välillä, kuten latinalaisessa kristikunnassa kehitettiin.