En el Imperio bizantino, la iglesia y el estado estaban indisolublemente vinculados como aspectos esenciales de un solo imperio cristiano que se pensaba como la contraparte terrestre de la política celestial. Por lo tanto, era deber de Justiniano, como lo fue para los emperadores bizantinos posteriores, promover el buen gobierno de la iglesia y defender la enseñanza ortodoxa. Esto explica por qué tantas de sus leyes tratan en detalle los problemas religiosos. A los paganos, herejes y samaritanos, por ejemplo, se les prohibió enseñar cualquier materia y, aunque apreciaba plenamente la herencia clásica, Justiniano expulsó a los maestros paganos de la una vez famosa Academia de Atenas, una acción dirigida contra el paganismo en lugar de la filosofía griega. .
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El principal problema doctrinal de Justiniano era el conflicto entre la visión ortodoxa aceptada en el Concilio de Calcedonia (451), de que las naturalezas divina y humana coexisten en Cristo, y la enseñanza monofisita que enfatizaba su naturaleza divina. El monofisismo estaba fuertemente arraigado en Siria y Egipto y estaba estrechamente relacionado con los crecientes sentimientos nacionales y el resentimiento por el dominio bizantino. Justiniano, cuya esposa, Teodora, era una fuerte defensora de los monofisitas, no deseaba perder las provincias orientales, pero sabía, por otro lado, que cualquier concesión a ellas casi con certeza alienaría a Roma y Occidente. Justiniano trató de obligar a los obispos occidentales ortodoxos a llegar a un compromiso con los monofisitas, e incluso llegó a tomar al Papa Vigilio contra su voluntad en Constantinopla y condenar algunos escritos de importantes figuras de la iglesia en Antioquía en un esfuerzo por lograr su objetivo. apuntar. El segundo Concilio de Constantinopla (553) finalmente reafirmó la posición de Calcedonia y condenó los escritos sospechosos de Antioquía. Sin embargo, Justiniano no logró nada con el episodio; no concilió a los monofisitas, enfureció a Antioquía por el ataque a sus maestros, y despertó a Roma particularmente por su manejo del papa Vigilio y su intento de determinar asuntos doctrinales. Los sucesores de Vigilio no aceptaron los decretos del concilio, por lo que se produjo un cisma entre Roma y Constantinopla que duró hasta el año 610.
Hacia el final de su reinado, Justiniano se retiró en cierta medida de los asuntos públicos y estaba ocupado con problemas teológicos. Incluso cayó en la herejía cuando, a fines de 564, emitió un edicto declarando que el cuerpo humano de Cristo era incorruptible y solo parecía sufrir (la doctrina llamada Aftartodocetismo). Esto provocó una protesta inmediata, y muchos eclesiásticos se negaron a suscribirla, pero el asunto se abandonó con la muerte del emperador, momento en el que el trono pasó a su sobrino Justino II en 565. Para describir el interés y la actividad de Justiniano en los asuntos de la iglesia como cesaropapismo ( estado en control de la iglesia) es engañoso. Justiniano, al igual que los sucesivos emperadores bizantinos, se consideraba a sí mismo como el viceregente de Cristo, y el Imperio Romano de Oriente no conocía una distinción tan clara entre iglesia y estado como se desarrolló en la cristiandad latina.