Die reverse Transkription beginnt, wenn das Viruspartikel in das Zytoplasma einer Zielzelle gelangt. Das virale RNA-Genom gelangt als Teil eines nicht gut charakterisierten Nukleoproteinkomplexes in das Zytoplasma. Der Prozess der reversen Transkription erzeugt im Zytoplasma über eine komplizierte Reihe von Schritten einen linearen DNA-Duplex. Diese DNA ist mit ihrer RNA-Matrize kolinear, enthält jedoch terminale Duplikationen, die als Long Terminal Repeats (LTRs) bekannt sind und in viraler RNA nicht vorhanden sind (Abb. 1). Vorhandene Modelle für die reverse Transkription schlagen vor, dass zwei spezialisierte Template-Schalter, die als Strangtransferreaktionen oder „Sprünge“ bekannt sind, erforderlich sind, um die LTRs zu erzeugen.
Abbildung 1
Die reverse Transkription des viralen RNA-Genoms erzeugt einen linearen DNA-Duplex. Die Positionen der R-, U5- und U3-Regionen, des Polypurin-Trakts (PPT) und der Primerbindungsstelle (PBS) sind angegeben. Reverse Transkription erzeugt Duplikationen des U5 (mehr …)
Die retrovirale DNA-Synthese hängt absolut von den zwei unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten von RT ab: a DNA-Polymerase, die entweder RNA oder DNA als Matrize verwenden kann, und eine Nuklease, Ribonuklease H (RNase H) genannt, die spezifisch für den RNA-Strang von RNA ist: DNA-Duplexe. Obwohl eine Rolle für andere Proteine nicht ausgeschlossen werden kann, und Es ist wahrscheinlich, dass bestimmte virale Proteine (z. B. Nucleocapsid, NC) die Effizienz der reversen Transkription erhöhen, wobei alle enzymatischen Funktionen erforderlich sind, um c Die vollständige Reihe von Schritten, die an der Erzeugung einer retroviralen DNA beteiligt sind, kann entweder der DNA-Polymerase oder der RNase H von RT zugeschrieben werden. Es wird angenommen, dass der Prozess der retroviralen DNA-Synthese dem in 2 dargestellten Schema folgt: Die Minusstrang-DNA-Synthese wird unter Verwendung des 3-Endes einer teilweise abgewickelten Transfer-RNA initiiert, die an die Primerbindung gebunden ist Stelle (PBS) in genomischer RNA als Primer. Die Minusstrang-DNA-Synthese wird fortgesetzt, bis das 5-Ende der genomischen RNA erreicht ist, wodurch ein DNA-Intermediat von diskreter Länge erzeugt wird, das als Minusstrang-Strong-Stop-DNA (–sssDNA) bezeichnet wird. Da sich die Bindungsstelle für den tRNA-Primer nahe dem 5-Ende der viralen RNA befindet, ist –sssDNA relativ kurz und liegt in der Größenordnung von 100–150 Basen
nach RNase-H-vermitteltem Abbau des RNA-Strangs des RNA: –sssDNA-Duplex bewirkt der Erststrangtransfer, dass –sssDNA an das 3-Ende einer viralen genomischen RNA gebunden wird. Dieser Transfer wird durch identische Sequenzen vermittelt, die als wiederholte (R) Sequenzen bekannt sind und an den 5- und 3-Enden des RNA-Genoms vorhanden sind. Das 3-Ende von –sssDNA wurde von den R-Sequenzen am 5-Ende des viralen Genoms kopiert und enthält daher Sequenzen, die zu R komplementär sind. Nachdem die RNA-Matrize entfernt wurde, kann –sssDNA an die R-Sequenzen am 3-Ende binden. Ende des RNA-Genoms. Die Annealing-Reaktion scheint durch die NC erleichtert zu werden.
Sobald die –sssDNA auf virale RNA in das 3R-Segment übertragen wurde, wird die Minusstrang-DNA-Synthese fortgesetzt, begleitet von einem RNase H-Verdau des Templates Strand. Dieser Abbau ist jedoch nicht vollständig.
Das RNA-Genom enthält einen kurzen Polypurin-Trakt (PPT), der relativ resistent gegen den RNase H-Abbau ist. Ein definiertes RNA-Segment, das aus der PPT-Primzahl-Plusstrang-DNA-Synthese abgeleitet ist. Die Plusstrangsynthese wird gestoppt, nachdem ein Teil der Primer-tRNA revers transkribiert wurde, was eine DNA ergibt, die als Plusstrang-Strong-Stop-DNA (+ sssDNA) bezeichnet wird. Obwohl alle Stämme von Retroviren einen definierten Plusstrang-Primer aus der PPT erzeugen, erzeugen einige Viren zusätzliche Plusstrang-Primer aus dem RNA-Genom. RNase H entfernt die Primer-tRNA und legt Sequenzen in + sssDNA frei, die sind komplementär zu Sequenzen am oder nahe dem 3-Ende der Plusstrang-DNA. Das Annealing der komplementären PBS-Segmente in + sssDNA- und Minusstrang-DNA bildet den Zweitstrangtransfer.
Plus- und Minusstrangsynthesen werden dann abgeschlossen, wobei die Plus- und Minusstränge der DNA jeweils als Vorlage für den anderen Strang dienen.
Abbildung 2
Prozess der reversen Transkription des retroviralen Genoms. (Schwarze Linie) RNA; (helle Farbe) Minusstrang-DNAs; (dunkle Farbe) Plusstrang-DNA. Eine Beschreibung dieses Prozesses finden Sie im Text.
Eine detailliertere Beschreibung dieser Schritte finden Sie unten.