În Imperiul Bizantin, biserica și statul erau indisolubil legate ca aspecte esențiale ale unui singur imperiu creștin care a fost considerat omologul terestru al politicii cerești. Prin urmare, a fost datoria lui Iustinian, așa cum a fost pentru împărații bizantini mai târziu, să promoveze buna guvernare a bisericii și să susțină învățătura ortodoxă. Aceasta explică de ce atâtea legi ale sale se ocupă în detaliu de problemele religioase. Păgânilor, ereticilor și samaritenilor, de exemplu, li s-a interzis să predea orice subiect și, deși apreciază pe deplin moștenirea clasică, Iustinian a expulzat profesori păgâni din Academia de la Atena, cândva faimoasă, o acțiune îndreptată împotriva păgânismului, mai degrabă decât filosofiei grecești. .
Principala problemă doctrinară a lui Justinian a fost conflictul dintre concepția ortodoxă acceptată la Conciliul de la Calcedon (451), că naturile divine și umane coexistă în Hristos și învățătura monofizită care a subliniat natura sa divină. Monofizitismul a fost puternic ținut în Siria și Egipt și a fost strâns aliat cu sentimentele naționale în creștere și resentimentele față de stăpânirea bizantină. Iustinian, a cărui soție, Theodora, era o puternică campioană a monofizitilor, nu dorea să piardă provinciile din est, dar știa, pe de altă parte, că orice concesii aduse acestora vor înstrăina aproape sigur Roma și Occidentul. Iustinian a încercat să-i oblige pe episcopii ortodocși occidentali să ajungă la un compromis cu monofiziții și a mers chiar atât de departe încât să-l țină pe Papa Vigilius împotriva voinței sale la Constantinopol și să condamne unele scrieri ale unor importante personalități bisericești din Antiohia într-un efort de a-și atinge scop. Al doilea Sinod din Constantinopol (553) a reafirmat în cele din urmă poziția calcedoniană și a condamnat scrierile suspecte ale Antiohiei. Cu toate acestea, Justinian nu a realizat nimic prin episod; el nu a conciliat monofiziții, a înfuriat Antiohia prin atacul asupra profesorilor săi și a stârnit Roma în special prin tratarea Papei Vigilius și încercarea sa de a determina problemele doctrinare. Decretele sinodului nu au fost acceptate de succesorii lui Vigilius și s-a produs astfel o schismă între Roma și Constantinopol care a durat până în 610.
Spre sfârșitul domniei sale, Justinian s-a retras într-o oarecare măsură din afacerile publice și a fost ocupat cu probleme teologice. El a căzut chiar în erezie când, la sfârșitul anului 564, a emis un edict prin care se spunea că trupul uman al lui Hristos era incoruptibil și părea doar să sufere (doctrina numită Aphthartodocetism). Acest lucru a stârnit un protest imediat și mulți ecleziastici au refuzat să-l subscrie, dar problema a fost abandonată odată cu moartea împăratului, moment în care tronul i-a revenit nepotului său Iustin al II-lea în 565. Pentru a descrie interesul și activitatea lui Iustinian în treburile bisericii ca fiind cesaropapism ( stat care controlează biserica) este înșelătoare. Iustinian, la fel ca împărații bizantini care i-au urmat, s-a considerat viceregent al lui Hristos, iar Imperiul Roman de Răsărit nu cunoștea o distincție atât de clară între biserică și stat, așa cum s-a dezvoltat în creștinătatea latină.